Clonación de especies y senescencia
La clonación de una seta consiste en tomar un pequeño trozo del sombrero o del tallo de una seta y aislarlo en una solución nutritiva de agar hasta obtener su micelio. La ventaja de este método consiste en que obtenemos directamente el micelio de una única variedad/cepa de esa especie, sin pasar por las esporas y todo el proceso posterior de identificación de las diferentes variedades/cepas más prometedoras que esto conlleva. La variedad/cepa resultante del proceso de clonación es genética y productivamente idéntica a la de la seta orígen de la que hemos tomado y aislado ese pequeño trozo. Esto es una ventaja enorme desde el punto de vista de la obtención de nuevas especies y/o variedades para el cultivo. No obstante, debe tenerse en cuenta que no todas las especies de setas son cultivables. Por norma general solo pueden cultivarse algunas de las especies saprófitas y/o parásitas que podamos encontrar, pero no aquellas micorrizas y cuyo micelio se interrelaciona con las raíces de ciertos árboles y plantas. Por lo tanto el proceso de clonación de estas últimas especies sería inútil, amén de extraordinariamente dificultoso, si nuestro objetivo final es tratar de cultivarlas en interior (cosa que hasta día de hoy se ha demostrado imposible).
Volviendo a la temática de esta entrada, el principal problema que nos viene es que la clonación de una seta no es nada fácil debido a los grandes problemas de contaminación por bacterias y otros agentes que se dan continuamente durante todo el proceso. Además, hay que estar familiarizado con el uso del agar y con diferentes técnicas complejas de esterilización y desinfección, y mientras más joven sea la seta a clonar más oportunidades de éxito tendremos. Aunque el proceso de clonación es el mismo para especies silvestres que para especies que ya han sido cultivadas en interior, nos gusta separar ambos casos y hacer una reseña por separado de cada uno:
El proceso de clonación de setas silvestres que podemos encontrar en la naturaleza es siempre mucho más dificultoso al estar los cuerpos fructíferos expuestos en todo momentos a contaminantes agresivos que se encuentran en el aire exterior. Por ello habrá de realizarse siempre un proceso previo de desinfección de las superficies externas antes de tomar una muestra para su posterior clonación. La clonación de una especie silvestre tiene la ventaja de aumentar mucho las posibilidades de éxito de encontrar una buena variedad o cepa de cultivo (en comparación a si obtuviésemos sus esporas, las germináramos y posteriormente las clasificáramos en laboratorio), al haber fructificado ésta en un ambiente ciertamente adverso y haber demostrado que efectivamente su micelio produce setas interesantes. Habrá que tener en cuenta en qué condiciones ha fructificado cada especie y en qué sustratos para asemejarlas lo máximo posible artificialmente y tratar de cultivarlas en interior.
El proceso de clonación de setas cultivadas en interior es cuantitativamente más fácil que el anterior. Esto es debido fundamentalmente al control del ambiente exterior de cultivo que se tiene en cualquier instalación, así como del uso general de especies y variedades notablemente productivas y resistentes a contaminaciones externas. No en vano casi todas las variedades/cepas de especies que se cultivan han sido obtenidas en laboratorio atendiendo a estos factores de resistencia y fuerte crecimiento. Y podría decirse que lo que hacemos en MYCELIOR con la clonación es obtener dichas especies para reproducirlas posteriormente a nuestro antojo en los tiempos y cantidades que queramos, poniéndolas al alcance de cualquiera interesado en cultivarlas.
Existe también el problema intrínseco de senescencia, que hace (explicado de forma rápida y generalista) que tras muchas clonaciones de una misma variedad, ésta vaya perdiendo progresivamente su viabilidad celular y deje de ser apta para el cultivo. Por ello, durante el proceso de obtención de nuestro micelio usamos nuestras culturas madres de primera generación, para que el micelio que proporcionamos sea siempre joven y no se encuentre afectado por este problema. Esto mismo deberían hacer todas las compañías que venden micelio en cualquiera de sus formas (y el cliente o cultivador así debería exigirlo). Aunque a priori, con las especies de setas que vemos diariamente en nuestros mercados no hay que preocuparse por la senescencia, por lo menos, a corto/medio plazo.
¿Puede volver a obtenerse la cepa o variedad inicial si ocurre este problema?
Sí, pero con muchísimo trabajo. Siempre puede obtenerse un nuevo sello de esporas del cuerpo fructífero de una seta (cualquiera de ellas, sea silvestre o cultivada), germinarse, y con ello volver al origen. El problema es que ahora tendremos esa misma variedad y los otros cientos, miles o millones de ellas que la acompañan. Y entonces se debería volver a comenzar el proceso de nuevo de separación e identificación hasta volver a aislar esa cepa/variedad que originalmente estábamos cultivando. Por lo tanto, debe quedar claro que usando esporas volvemos siempre al ORÍGEN, pero probablemente nunca volvamos a encontrar esa cepa o variedad que tan buenos resultados nos daba anteriormente. De ahí que siempre recomendemos el uso de micelio en vez de esporas, aunque su obtención sea mucho más dificultosa. Prestad mucha atención porque siempre habrá vendedores que intentarán engañaros hablando de micelio líquido de cepas o variedades extraordinarias en la descripción de sus productos, y realmente lo que hacen es diluir el contenido de un sello de esporas en agua e introducirlo en una jeringa, vendiéndolo luego a un precio abusivo y desorbitado. El micelio líquido es fácilmente distinguible a simple vista, como veremos más adelante .Y eso sin hablar de que ese líquido no incluya contaminantes establecidos por un proceso y/o manejo deficientes. No os fieis. Os sorprendería conocer las veces que los productos que se venden están contaminados. Y descubrir esto, aparte de no ser nada fácil ni rápido, lleva asociado previamente el haber perdido varios cultivos, sustratos, y los correspondientes recursos, dinero y tiempo.
hola, la solución nutritiva siempre es de agar?
Para realizar las clonaciones sí, ya que es necesario utilizar placas petri estériles elaboradas con una solución nutritiva adecuada para el crecimiento del micelio y agar que la solidifique. Lo que se suele hacer es elaborar una solución nutritiva acuosa a la que se le añaden unos gramos de agar agar por litro de solución (pulverizado o en hebras). Este conjunto se esteriliza a 121 grados y 15 PSI el tiempo suficiente. Pasado este tiempo y delante de una campana de flujo laminar, se vierte la solución (con el agar ya derretido y disuelto en ella) sobre cada placa y se deja enfriar hasta solidificarse en el interior de cada una. Una vez sólidas y a temperatura ambiente, ya se puede empezar la clonación colocando muestras de las setas o el micelio sobre la superficie solidificada de la solución nutritiva de cada placa.
Agradecido por la info, muy bueno! pregunto desde mi ignorancia, al no contar con una campana de flujo laminar, puedo preparar el agar en las placas para luego esterilizar el conjunto y trabajarlo en glovebox?
Puedes preparar el agar en las placas siempre que estas sean de vidrio (para soportar la esterilización sin derretirse) y calcules la cantidad exacta de gramos de agar y ml de solución que te harían falta por placa, cosa sinceramente muy difícil. Lo que se suele hacer es usar un erlenmeyer donde verter los gramos de agar y ml de solución necesarios. Luego se le coloca un filtro de algodón sintético o celulosa, se cubre su boca con papel de aluminio y se esteriliza. También se puede usar un tarro de vidrio con tapa en lugar del erlenmeyer. Una vez terminado el ciclo de esterilización, y con el conjunto aún caliente, puedes introducirlo en la glovebox y allí abrir las placas (que suelen ser de plástico y venir estériles) y verter en cada una un poco de la solución con agar. Luego las dejas enfriar y ya podrás inocularlas.
yo tengo experiencia en esterilizacion con ozono ambiental, podrìa ser una soluciòn para no usar flujo laminar, el ozono elimina esporas, microorganismos etc
hay experiencia con ozono? se me ocurre por muchos usos que tiene
Buenas tardes Emilio. La campana de flujo laminar no solo filtra estos microorganismos, sino que también previene el movimiento turbulento de aire en la boca de las bolsas (lo expulsa laminarmente, como una cortina continua) y mantiene un caudal de salida del aire constante. El ozono jamás limpiaría todos los contaminantes que portas en tu propio cuerpo y ropa durante la inoculación, los cuales pueden pasar fácilmente al interior de las bolsas de sustrato esterilizado, placas petri o Spawn.
Hola, es viable hacer un cultivo indor a escala mas industrial, ya que como mèdico uso la psilocibina para tratar adicciones, y preciso mas cantidad, ya que el cultivo casero es poco, cuanto se calcula de superficie kg de hongos y cuanto se extrae de psilocibina por kgr aprox
gracias
Buenas tardes Emilio. El kg de hongos por m2 dependerá de la productividad de los sustratos de cultivo, de las propias especies y del grado de llenado de las salas de fructificación. Para poder darte un parámetro productivo concreto deberíamos analizar tu caso concreto y tus instalaciones. Con respecto a la psilocibina, es un dato que desconocemos porque nos dedicamos fundamentalmente a las setas comestibles y medicinales, y en España el cultivo de esta sustancia queda prohibido. Aunque es cierto que los diferentes tipos de setas que la producen se cultivan de forma análoga a los tipos que setas con los que nosotros trabajamos, de ahí que podamos resolverle a algunos de nuestros usuarios la mayoría de las dudas de cultivo que tienen con estas setas. Saludos.
Hola, estimados!
Mi consulta es la siguiente.
En los procesos de clonación que se mencionan, solo sería de primera generación el extraído directamente de la espora, verdad? No se degeneraría progresivamente el micelio al ir seccionándolo? o a qué se refieren con partir de micelio en vez de esporas?
Gracias!
Buenas tarde Pablo. Lo has entendido perfectamente. El micelio de primera generación por definición sería el obtenido por primera vez de la germinación directa de dos esporas. Pero a nivel de laboratorio, se lo considera de primera generación (o así debería ser) cuando no se ha multiplicado en grano. Te ponemos un ejemplo:
Si germinamos y sectorizamos una placa petri hasta obtener una fuente pura de micelio y posteriormente la dividimos en 10 nuevas placas, cada una de ellas se seguiría considerando de primera generación. Este es el método de conservación prolongada de cualquier especie de seta. Ahora cogemos una de esas placas y la vertemos sobre una bolsa de grano esterilizado. Pasado un mes, cogemos un solo grano de esa bolsa y lo inoculamos en una nueva placa petri. Ese micelio podríamos considerarlo de segunda generación, porque ha sufrido previamente una subdivisión mucho más agresiva que la sufrida por pasarlo de una placa a otra. A muy largo plazo (decenas de años), es posible que el micelio pasado de placa a placa acabe degradándose (senescencia), pero para eso hay bancos mundiales de conservación a muy largo plazo y a muy baja temperatura. En cambio, si lo multiplicamos continuamente en grano durará muy pocos años de forma que sea productivamente viable.
A partir de micelio en lugar de esporas, nos referimos a producir setas usando variedades en lugar de sellos o soluciones de esporas. El micelio obtenido de sellos o soluciones (jeringas) de esporas tendrá muchísimas variedades entrelazadas si no se han sectorizado en laboratorio. En cambio el micelio obtenido por clonación directa solo contendrá una única variedad de la especie concreta de seta clonada (ya proceda de una seta fresca, de una placa de agar o del mismo Spawn). Y a nivel doméstico, podemos permitirnos tranquilamente partir en nuestros cultivos de un micelio de tercera o cuarta generación sin tener que preocuparnos de su productividad. Sin embargo todo cambiaría si produjéramos a escala industrial, donde la genética y juventud de las especies juega un papel productivo fundamental en los rendimientos obtenidos.
Saludos!
Buenas, me quedan dudas sobre la generación del micelio a la hora de mantener intacta la cepa. Pongo dos situaciones:
A)
Cojo una seta joven de ostra por ejemplo. Corto un trozo y la introduzco en una placa petri. Pasado el tiempo se obtiene el micelio. Cojo ese micelio, lo hago 10 partes y meto cada una en otra placa petri. El micelio obtenido en cada una de esas 10 placas lo vuelvo a hacer 10 trozos y cada trozo lo ponemos nuevamente en otra placa petri para obtener nuevo micelio. ¿La placa inicial, las 10 placas segundas y las 100 finales serían todas de primera generación? Si repito el procedimiento de manera indefinida, ¿siempre estaríamos hablando de micelio de primera generación?¿Es aconsejable este procedimiento?
B) Ahora otro camino para multiplicar el micelio. Cojo una seta joven y vuelvo a clonar en una placa petri. Obtenido el micelio, hago 10 trozos y los introduzco en 10 botes con grano para obtener micelio en grano que si no me equivoco se conoce como spawn. Una vez colonizado todo el grano inoculo 10 bolsas de sustrato con esos 10 botes de spawn, incubo, fructifico, obtengo la primera florada, cojo de nuevo una seta joven de esta florada y repito todo el procedimiento anterior para obtener otros 10 botes de spawn y así hasta el fin de los días :). ¿Conseguiríamos mantener la cepa, su productividad y que el micelio obtenido en cada repetición del procedimiento fuese de primera generación?
C) Por último, para inocular el sustrato y obtener la alpaca, ¿es mejor hacerlo usando spawn o echando varios trocitos de micelio de la placa petri?
Disculpad la extensión y si no me explico bien. Muchas gracias.
Buenas tardes José. Muy buena consulta la que nos planteas. Te la contestamos paso a paso:
A)
Teóricamente sí, se considerarían todas de primera generación porque realmente la subdivisión celular sería muy reducida. Piensa que el peso de una placa Petri puede andar en torno a 10-20 gramos, y que una bolsa de Spawn puede pesar entre 3 y 9 kg. Para elaborar esa bolsa de Spawn solo necesitarías una única placa, y pasarías a una multiplicación de micelio en dos dimensiones y de 10 – 20 gramos a otra en tres dimensiones de 3000-9000 gramos.
Realmente, en estos casos lo que se hace es utilizar los slants de conservación prolongada, para evitar una sobre propagación y partir siempre de una muestra madre. Se toma una pequeñísima muestra de ese slant refrigerado, se pasa a una placa petri, esa placa se sectoriza en otras 8 o 10 placas más, y cada una de esas placas se consideran madre también. Pasar de una placa a 10 no implica riesgo alguno de senescencia por subdivisión, y haciendo DOS multiplicaciones G2G de Spawn (grain to grain) podríamos obtener más de 20 toneladas de setas de una sola placa. Es decir, una de esas placas la pasaríamos a una bolsa de Spawn. Esa bolsa de Spawn la utilizaríamos para crear otras 20 bolsas de Spawn. Y cada una de esas 20 bolsas las utilizaríamos para crear otras 20 bolsas nuevas a partir de cada una. Así lo hacen los laboratorios que fabrican micelio a escala muy grande. Su secreto es que el slant madre también es muy joven y productivo.
B)
Esto ya no funciona así. La seta es una prolongación del micelio. Es decir, es micelio puro y duro. Por lo tanto cuando clonamos una seta ya cultivada no estamos rejuveneciendo el micelio ni volviendo a una generación inicial. Esto solo «pasa» (y no quiero que se tome como norma porque habría que estudiar bien cada caso) con el micelio (o setas) que han brotado a muy corto plazo de la unión de dos esporas. Si esto fuera como propones, estos grandes laboratorios estarían continuamente fructificando, clonando y rejuveneciendo sus propias setas. O haciendo los mismo con las setas de los supermercados de su competencia.
C)
Estás pasando por alto uno de los parámetros más importantes del cultivo de setas: el número de puntos de inoculación. El Spawn le entrega al sustrato nutrientes muy importantes que este no tiene si no está suplementado (recuerda que si está suplementado necesita esterilizarse, diferente a pasteurizarse). Pero sobre todo lo que le entrega son muchos puntos de inoculación que se mezclarán por toda su masa, fusionándose uno con otro durante el proceso de colonización (incubación). Echarle directamente una placa petri puede funcionar solamente en un sustrato pequeño, muy bien esterilizado y con un buen filtro. Pero lo más importante durante la colonización es incubar las bolsas en el menor tiempo posible. Y eso solo se consigue aumentando el nivel de Spawn mientras nos mantengamos en un punto en el que nos salga rentable.
Esperamos haberos aclarado todas estas dudas. Saludos.
Muchas gracias por el detalle en las respuestas. Dudas aclaradas jejeje. Ahora viene lo que suele ser habitual, de la resolución de unas dudas salen otras jejeje. Muy rápido, enumero dudas nuevamente:
A) Con lo de las dimensiones me he perdido. Disculpa.
B) Estoy flipando con que con una placa petri se pueda sacar 9 kg de micelio en grano. Imagino que será recomendable que esos 9 kg sean repartidos por ejemplo en botes o bolsas de 1 kg de grano y a cada kilo echarle uno de los 10 trozos de esa placa petri.
C) Respecto a la cuestión B) del mensaje anterior, si no se recomienda volver a obtener micelio de una seta obtenida con un micelio anterior, cómo se mantiene una cepa para tener siempre disponible micelio de primera generación para fabricar Spawn. No sé si me explico.
Saludos.
Hola de nuevo José. Te lo intento explicar:
A) Lo de las dimensiones es una tontería. Simplemente que en una placa petri el micelio crece solamente hacia los lados; o en un plano. Es decir, en dos dimensiones. Y que en una bolsa de grano esterilizado el micelio crece en tres dimensiones, es decir, ocupando todo el volumen de la bolsa. Por lo tanto el nivel de crecimiento (su expansión) del micelio es muchísimo mayor en una bolsa que en una placa petri. De ahí se podría interpretar lo del cambio de generación en las bolsas y no en las placas.
B) Realmente es más, y de una sola placa petri se podrían sacar cientos o miles de kilos de Spawn si el micelio es lo suficientemente joven.
Lo normal es echar una placa (o media, o incluso un tercio, pero no menos) por bote o bolsa de Spawn.
C) Realmente hay hasta tres formas de mantenerlo, aunque en la práctica los grandes laboratorios suelen emplear las tres:
1- Por métodos de almacenamiento prolongado, fundamentalmente a muy bajas temperaturas.
2- Renovando los slants cada 3 o 6 meses (llegan a aguantar hasta un año sin envejecer el micelio si están hechos convenientemente).
3- Utilizando placas «madres» y sectorizándolas en un número suficiente de placas nuevas.
Respecto a la cuestión B) del primer mensaje creo que ya he comprendido cómo mantener la cepa en el tiempo. Se trata de ir obteniendo nuevos slants a partir de los anteriores ya que las muestras madres conservadas en los tubos de ensayo en refrigerador, siempre van a ser muestras madre (G0). Así se mantiene la juventud del micelio. ¿Es así?
Saludos.
Exactamente, es justo eso. Aunque más bien los pasos son:
1- De una muestra de micelio de un slant obtengo una placa madre. Con el resto de muestras hago nuevos slants (al menos otros tres).
2- Sectorizo (divido) esa placa madre, y de ella obtengo nuevas placas adicionales.
3- Utilizo esas nuevas placas para inocular grano esterilizado y generar Spawn «G1», que puedo utilizar directamente para inocular sustrato o para generar nuevo Spawn «G2». Algunas empresas incluso llegan a utilizar ese Spawn G2 para generar nuevo Spawn «G3″…
Saludos.